Diseño de un modelo in vitro de células epiteliales primarias gingivales humanas para evaluar infectividad de Helicobacter pylori (ATCC 43504)
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2019-10-02
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Resumen
Antecedentes: La evidencia sobre patologías bucales asociadas a Helicobacter pylori es controversial, especialmente porque no hay certeza sobre la capacidad infectante de la bacteria en tejido oral. Por lo tanto, es importante evaluar metodologías para establecer la capacidad de adhesión de H. pylori a la célula hospedera en el proceso de patogénesis.
Objetivo: Evaluar la capacidad infectante de H. pylori (ATCC 43504) en células epiteliales primarias gingivales humanas.
Metodología: Biopsias de encías humanas de donantes sanos se disgregaron mecánicamente y se digirieron con enzimas proteolíticas y con antioxidantes. El sedimento celular se suspendió en medio Williams suplementado con antimicrobianos, suero bovino fetal y factores de crecimiento. Las células se cultivaron por dos semanas en placas de 12 pozos a 37°C y atmósfera CO2 al 10%. El fenotipo epitelial se confirmó por coloración de Hematoxilina & Eosina (H&E) e inmunohistoquímica para el antígeno epitelial de membrana (AEM) y coctel de citoqueratinas AE1/AE3. La evaluación de la capacidad de infección se realizó por inmunofluorescencia indirecta (IFI) con anticuerpo anti H. pylori. Se utilizó una multiplicidad de infección MOI (bacteria: célula) de 100 en monocapas con 70% de confluencia; como controles positivo y negativo de la infección se utilizaron líneas de células tumorales gástricas (AGS) y células embrionarias de riñón (293TN) de origen humano, respectivamente.
Resultados y conclusiones: Se aislaron células gingivales viables y proliferantes, con confluencia inicial del 20% a las 72 horas y un 100% a los diez días de incubación. La coloración H&E evidenció la morfología epitelial de células planas de forma cilíndrica y núcleo prominente; y se confirmó el fenotipo de origen epitelial con AEM y AE1/AE3 (positividad de 80% y 60%, respectivamente). La IFI demostró ausencia de H. pylori en las células gingivales primarias con fluorescencia 0.4 ± 0.5%, mientras que los controles positivos y negativos presentaron 99.4 ± 0.9 % y 19.2 ± 1.1 % de positividad, respectivamente. Los resultados obtenidos sugieren que la cepa ATCC 43504 de H. pylori no tiene capacidad de adhesión a células epiteliales primarias gingivales humanas. Por consiguiente, se puede sugerir que la cepa evaluada de H. pylori participaría como microorganismo comensal transitorio en la cavidad bucal.
Abstract
Background: Evidence on oral pathologies associated with Helicobacter pylori is controversial, especially because there is no certainty about the infecting capacity of the bacteria in oral tissue. Therefore, it is important to evaluate methodologies to establish the adhesion capacity of H. pylori to the host cell in the process of pathogenesis.
Objective: To evaluate infectious capacity of H. pylori (ATCC 43504) to infect on Human Primary Gingival Epithelial Cells.
Methodology: Human gingival biopsies from healthy donors were mechanically disrupted and digested with proteolytic enzymes and antioxidants. The cell pellet was suspended in Williams’ medium supplemented with antimicrobials, fetal bovine serum and growth factors. Cells were cultured for two weeks in 12-well plates at 37°C and 10% CO2 atmosphere. The epithelial phenotype was confirmed by Hematoxylin & Eosin staining (H&E) and immunohistochemistry for membrane epithelial membrane antigen (EMA) and cytokeratin cocktail AE1/AE3. The evaluation of the infectious capacity was carried out by indirect immunofluorescence (IFI) with anti-H.pylori antibody. A multiplicity of infection MOI (bacteria: cell) of 100 in monolayers with 70% confluence was used; As positive and negative controls of the infection, gastric tumor cell lines (AGS) and kidney embryonic cells (293TN) of human origin were used, respectively.
Results and conclusions: Viable and proliferating gingival cells were isolated, with initial confluence of 20% at 72 hours and 100% at ten days of incubation. H&E staining evidenced the epithelial morphology of flat cells with a cylindrical shape and a prominent nucleus; and the phenotype of epithelial origin was confirmed with EMA and AE1/AE3 (positivity of 80% and 60%, respectively). IFI demonstrated absence of H. pylori in the primary gingival cells with fluorescence 0.4 ± 0.5%, while the positive and negative controls showed 99.4 ± 0.9% and 19.2 ± 1.1% positivity, respectively. The results obtained suggest that strain ATCC 43504 of H. pylori does not have the capacity of adhesion to human primary gingival epithelial cells. Therefore, it can be suggested that the evaluated strain of H. pylori would participate as a transient commensal microorganism in the oral cavity.
Idioma
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Citación
Macías Gómez, F. (2019). Diseño de un modelo in vitro de células epiteliales primarias gingivales humanas para evaluar infectividad de Helicobacter pylori (ATCC 43504) [Tesis de grado]. Universidad Santo Tomás, Bucaramanga, Colombia